Potencjał ludzkiej błony owodniowej

Owodnia to bardzo cienka i przezroczysta błona otaczająca rozwijający się płód (0,02- 0,5mm) zbudowana z kilku warstw:

• z nabłonka cylindrycznego, bogatego w czynniki wzrostu (EGF, KGF, IL-4, IL-6, HGF, TGF, FGF);
• błony podstawnej, zbudowanej z kolagenu IV i VII, laminy, fibronektyny;
• beznaczyniowego zrębu, zawierającego czynnik wzrostu nerwów, inhibitory proteazy, białka przeciwzapalne oraz białka hamujące angiogenezę (Gawryluk i Noszczyk, 2015).

 Zastosowanie owodni w okulistyce jest bardzo powszechne, w literaturze można znaleźć szereg prac, które powstały w oparciu o badania medyczne nad opracowaniem najlepszej strategii w walce z chorobami i urazami gałki ocznej. Tabatabaei i współpracownicy (2017) badali wpływ zastosowania membrany owodniowej na leczenie bakteryjnego zapalenia spojówki, Ma i współpracownicy (2016) opracowali nową strategię użycia płatów owodni do leczenia zespołu Stevens-Jonshona. Cheng i współpracownicy (2016) zastosowali z powodzeniem owodnię do leczenia syndromu suchego oka.

Przeszczepy owodni można stosować również w takich chorobach jak:

– poparzenia chemiczne i termiczne gałki ocznej,

– przewlekłe keratopatie neurotroficzne,

– obrzęki rogówki po usunięciu zaćmy,

– stożka rogówki,

– blizny po zapaleniu herpetycznym rogówki,

– owrzodzenia rogówki,

– zapalenie miąższowe,

– urazy gałki ocznej,

– zwyrodnienia i dystrofie rogówki,

– zakażenia gałki ocznej o różnym podłożu

– skrzydlik

Nowe dane pokazują również, że coraz częściej naukowcy i lekarze wykorzystują owodnię do leczenia ran skórnych. Eskandarlou i współpracownicy (2015) przeprowadzili badania kliniczne na 32 pacjentach, u których zastosowano opatrunki z owodni do leczenia ran oparzeniowych. U większości pacjentów zauważono zmniejszenie odczuwania dolegliwości bólowych, a także zwiększoną reepitelializację w miejscach oparzeń. Choi i współpracownicy (2013) zastosowali z powodzeniem nowoczesny, podwójny system opatrunków, w których użyli ekstraktu z błony owodniowej, jako środka nawilżającego rany.

Dehydratowane błony płodowe: kosmówka oraz owodnia (ang. human dehydrated chorion-amnion membranę) stosowane są przez lekarzy głównie w leczeniu oparzeń niepełnej i pełnej grubości skóry, a także w terapii ran ostrych oraz przewlekłych, trudno gojących się. Wykazano, że zastosowanie dehydratowanej owodni w połączeniu z kosmówką moduluje proces zapalny jak również redukuje powstawanie blizn oraz wspomaga proces gojenia.

Ludzka błona owodniowa posiada właściwości antybakteryjne. Połączenie błon: owodni i kosmówki jest wykorzystywane w opatrywaniu nacięć chirurgicznych, w gojeniu ran, w leczeniu oparzeń, jak również w stomatologii i okulistyce.

Z badań wynika również, że nie zawsze stosowanie opatrunków i przeszczepów owodni jest w pełni skuteczne i wygodne, stąd podjęto próby sporządzenia ekstraktu z owodni, który miałby zachować jej wszystkie właściwości, ale miałby łatwiejszą do zastosowania formułę, bez konieczności wykonywania skomplikowanych i obarczonych ryzykiem, zabiegów chirurgicznych.

Ekstrakt z owodni otrzymuje się najczęściej poprzez  zliofilizowanie tkanki owodniowej, a następnie jej sproszkowanie. Nstępnie rozpuszcza się proszek poprzez użycie odpowiedniego rozpuszczalnika, dzięki czemu uzyskuje się tzw. wyciąg z tkanki. Do ekstraktu dostają się biomolekuły zawarte w tkance, a w szczególności czynniki wzrostu i cytokiny.

Wyniki badań potwierdzają, że krioprezerwacja jest delikatniejszą metodą konserwacji ludzkich błon płodowych w porównaniu z dehydratacją oraz wskazują na to, że utrzymanie żywych, aktywnych komórek (w tym m.in. mezenchymalnych komórek macierzystych) wywiera wpływ na funkcjonalność tych błon w modelach gojenia ran, zarówno in vitro jak i in vivo.

Wciąż jednak potrzeba badań potwierdzających kliniczne znaczenie substytutów skóry zawierających żywe komórki….

Spółka CDC Poland realizowała projekt pod nazwą: „Opracowanie innowacyjnego produktu w formie zawiesiny zliofilizowanej błony owodniowej do zastosowania w leczeniu trudno gojących się ran i blizn pooperacyjnych w okulistyce” współfinansowany z Europejskiego  Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach działania 1.2 “Badania i rozwój w  sektorze świętokrzyskiej przedsiębiorczości” osi I “Innowacje i nauka” Regionalnego Programu Operacyjnego Województwa Świętokrzyskiego na lata  2014 – 2020.

W pierwszej kolejności prace B+R obejmowały opracowanie sposobów kwalifikacji dawczyń oraz ustalenie kwestii formalno-prawnych związanych z przystąpieniem do realizacji badań z wykorzystaniem materiału pochodzenia ludzkiego. Aby materiał mógł być pobrany każda z dawczyń musiała wyrazić świadomą zgodę na pobranie błony owodniowej oraz zgodę na przetwarzanie danych osobowych. Zgody były potwierdzana złożeniem własnoręcznego podpisu na odpowiednich formularzach. Ponadto, na podstawie obowiązujących ustaw i rozporządzeń z zakresu pobierania, procesowania i przechowywania tkanek ludzkich ustalono również minimalny zestaw badań diagnostycznych dla dawczyń (zgodne z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia w sprawie wymagań, jakie powinien spełniać system zapewnienia jakości w bankach tkanek i komórek (Dz.U. 2008 nr 190 poz. 1169, ze zmianami). Przyjęto również szereg kryteriów akceptacji i wykluczenia błony owodniowej. Kwalifikacja ta obejmowała wykonanie lub weryfikację wykonania testów diagnostycznych, które wykluczały obecność zakażenia dawczyń wirusami HIV, HBV, HCV oraz kiłą, a także test wizualny wykluczający widoczne nieprawidłowości morfologiczne błony owodniowej. Następnie opracowano metody pobierania i oczyszczania błony owodniowej z krwi i skrzepów. Pobranie owodni rozpoczynano od cięcia wykonanego w pobliżu pępowiny, a następnie stosowano tępe cięcie oddzielając owodnię od kosmówki. Następnie opracowano sposoby pobierania owodni oraz procedury transportu.

W kolejnym etapie prac badawczo-rozwojowych skupiono się na opracowaniu metod procesowania pobranej błony owodniowej w laboratorium i przygotowaniu jej do procesu liofilizacji. Prowadzone prace miały na celu opracowanie efektywnego sposobu odpłukania resztek krwi i skrzepów z owodni oraz jej dekontaminację przez użycie roztworu z antybiotyków, aby zapewnić maksymalne bezpieczeństwo stosowanej owodni. Oczyszczanie błony owodniowej wykonywano poprzez przeprowadzenie cyklu płukań w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej oraz kąpiel antybiotykową w warunkach aseptycznych. Na tym etapie pobrano i zbankowano 100 błon owodniowych.

Następnie przeprowadzono próby proszkowania i liofilizacji owodni w celu zoptymalizowania warunków procesu oraz uzyskania produktu o najwyższych pożądanych parametrach. Błonę owodniową poddawano liofilizacji przy wybranych parametrach w dwóch postaciach, tj. we fragmencie (około 5x5cm) oraz w postaci proszku. Proszek owodniowy otrzymywano poprzez miażdżenie błony owodniowej w ciekłym azocie.

Sprawdzono aktywność biologiczną świeżej błony owodniowej, błony owodniowej liofilizowanej w płacie i liofilizowanego proszku owodniowego, poprzez oszacowanie zawartości czynników wzrostu w ekstraktach wymienionych postaci produktu na podstawie testów ELISA oraz poprzez prowadzenie hodowli komórkowych z dodatkiem produktu z błony owodniowej. W ten sposób wykazano obecność czynników wzrostu (substancje o charakterze białkowym), takich jak EGF, KGF, HGF, TGF i FGF. Ponadto w celu oceny klinicznego wpływu produktu na komórki ludzkie przeprowadzono hodowle komórkowe in vitro w obecności ekstraktu ze zliofiliozwanej owodni. Analizując otrzymane w postaci zdjęć mikroskopowych efekty można było jednoznacznie stwierdzić, że w wypadku obu typów hodowli komórkowych, suplementacja pożywki hodowlanej ekstraktem ze sproszkowanej liofilizowanej owodni powoduje szybszy wzrost komórek w stosunku do hodowli kontrolnej, czyli niesuplementowanej. Co więcej obserwowano, że efekt ten jest zależny od dawki – im większe stężenie zawiesiny z owodni w komórkach tym ich wzrost i proliferacja są szybsze.
Badanie to potwierdziło, że ekstrakt  wpływa na wzrost i proliferacje komórek  ze względu na obecność w jej strukturze aktywnych czynników wzrostu. Jednocześnie na tym etapie wykazano, że użyty rozpuszczalnik, tj. woda do wstrzykiwań, został dobrany właściwie do wykonania ekstraktu, tak że substancje zawarte w owodni (w szczególności czynniki wzrostu) zostały uwolnione do roztworu i zachowały swoja aktywność.

Bazując na dotychczas przeprowadzonych badaniach i ich pozytywnych wynikach wskazujących na obecność prozdrowotnych czynników wzrostu oraz wspomagania leczenia chorób oczu u ludzi przeprowadzono badania dodatkowe. Polegały one na ocenie wpływu ekstraktu z owodni na hodowle keratynocytów, czyli komórek naskórka. W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że zawiesina zliofilizowanej błony owodniowej przyspiesza proliferację keratynocytów i wydłuża ich żywotność.

Metody badawcze:

• Do ustalenia właściwości fizycznych wybrano:

• Do ustalenia właściwości chemicznych wybrano:
• pH,
• zawartość jonów Na+
• zawartość jonów K+
• zawartość jonów Cl-

Pomiary przeprowadzone zostały na mierniku wielofunkcyjnym Orion VersaStar PRO.

• Do określenia dystrybucji wielkości i stężenia cząstek wybrano analizę metodą Coultera (ang. electrozone sensing) sproszkowanej owodni zawieszonej w odpowiednim elektrolicie.
• Do określenia zwartości wody wybrano analizę fluktuacji zawartości wody na różnych etapach procesowania owodni.
• Analizę rozpuszczalności przeprowadzono w sterylnej wodzie dejonizowanej Merck Millipore oraz w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej 0,9% NaCl
• Ocenę wydajności izolacji grawitacyjnej będzie przeprowadzono w ramach wirowania roztworu sproszkowanej owodni w wodzie (wirówka chłodząca Eppendorf Centrifudge 5804R)
• Zawartość białka całkowitego – spośród dostępnych metod oraz występujących w owodni białek:
• Określenie zawartości białka całkowitego – oznaczenie absorbancji A280 przy użyciu spektrofotometru NanoDrop (NanoDrop One Thermo Scientific). Izolację białek przeprowadzono przy użyciu dwóch rozpuszczalników. (I – roztwór PBS, II – bufor do lizy Triton X-100)
• Analiza zawartości substancji czynnych –

Na podstawie literatury do identyfikacji wytypowano 5 czynników wzrostu – technika immunoenzymatyczna sandwich ELISA.

• EGF
• HGF
• KGF
• ƅFGF
• TGF-β1

.

• Badania proliferacji i angiogenezy przeprowadzono z linią komórek skóry – keratynocytów i zaproponowano metodę pozyskiwania ekstraktu z owodni do traktowania komórek. Badania wykazały, iż poziom proliferacji był szybszy o ok. 40% w przypadku komórek suplementowanych ekstraktem z błony owodniowej.
• Analizę wpływu owodni na proliferację keratynocytów przeprowadzono testem MTT i analizą mikroskopową z obliczeniem współczynnika proliferacji komórek oraz testem angiogenezy i metodą oszacowania szybkości tworzenia kanalików (hodowla w butelkach hodowlanych typu Falcon Canted Neck Tissue Culture Flask 25ml).
  • Badanie angiogenezy polegało na obserwacji zdolności tworzenia „naczyń” przez hodowle komórek śródbłonka w obecności ekstraktu z błony owodniowej w porównaniu do kontroli (hodowla bez suplementacji). Hodowle inkubowano z barwnikiem fluorescencyjnym i obserwowano przyżyciowo pod mikroskopem.
• Badania cytotoksyczności przeprowadzono na hodowli keratynocytów, których pożywka będzie suplementowana ekstraktem z owodni. W wyniku tych badań stwierdzono wzrost żywotności komórek (85% żywych komórek), co pozwala na sformułowanie wniosku, iż ekstrakt z błony owodniowej nie wywiera cytotoksycznego efektu na komórki skóry.
• Badanie biokompatybilności przeprowadzono z hodowlami keratynocytów. Do oceny biokompatybilności wykorzystany został test kometowy, który miał za zadanie oszacować potencjalną genotoksyczność podawanego ekstraktu. W wyniku przeprowadzonych analiz, w porównaniu do kontroli nie stwierdzono szkodliwego wpływu hAM-E na materiał genetyczny zawarty w komórkach keratynocytów.

Wyniki:

Każda z owodni została podzielona na cztery części i zakwalifikowana do odpowiednich grup odpisanych wcześniej.

• Grupa I – hAM-C Ludzka błona owodniowa poddana serii płukań w roztworze soli fizjologicznej.
• Grupa II – hAM-A Ludzka błona owodniowa poddana serii płukań w roztworze soli fizjologicznej oraz płukana w roztworze antybiotyków.
• Grupa III – hAM-F Ludzka błona owodniowa poddana serii płukań w roztworze soli fizjologicznej oraz płukana w roztworze antybiotyków, a następnie zamrożona.
• Grupa IV – hAM-N – Ludzka błona owodniowa poddana serii płukań w roztworze soli fizjologicznej oraz płukana w roztworze antybiotyków, a następnie miażdżona w ciekłym azocie. hAM-N wykorzystano do przygotowania hAM-E

Analizie pH poddano wszystkie przygotowane grupy badawcze hAM-A, hAM-F, hAM-N i kontrolę hAM-C. Żadna z grup badawczych nie wykazywała istotnych zmian wartości pH w stosunku do kontroli, którego wartość wynosiła średnio 7,32 (SD± 0,05).

Do określenia zawartości wyizolowanego białka całkowitego wybrano oznaczenie absorbancji A280 przy użyciu spektrofotometru typu NanoDrop

Określenie zawartości wyizolowanych czynników wzrostu było kontynuowane przy pomocy testu ELISA.

Poniższa tabela przedstawia wyniki cytotoksyczności. Za pomocą automatycznego licznika komórek sprawdzono przeżywalność komórek hodowanych. Kolejno wykonano analizę porównawczą przeżywalności komórek w próbach kontrolnych (bez dodatku owodni) i w próbach badawczych do których dodawana była taka sama ilość owodni, ale różniąca się sposobem przetwarzania materiału.

Informacje do tabeli

K – kontrola – hodowla komórkowa bez dodatku owodni

M – hodowla komórkowa z dodatkiem owodni  miażdżonej w ciekłym azocie przed liofilizacją

F – hodowla komórkowa z dodatkiem owodni liofilizowanej we fragmencie

Wnioski:

1. Przyjęte metody procesowania błony owodniowej nie zmieniają w sposób negatywny jej właściwości biologicznych, a w niektórych przypadkach jak np. miażdżenie w ciekłym azocie ,zwiększają obecność czynników wzrostu w badanych próbkach.
2. W wyniku przeprowadzonych analiz i w porównaniu do kontroli nie stwierdzono szkodliwego wpływu hAM-E na materiał genetyczny zawarty w testowanych komórkach.
3. Największa bezwzględna ilość poszczególnych czynników wzrostu znajduje się w owodni proszkowanej w ciekłym azocie.
4. Stwierdzono pozytywny wpływ ekstraktu z owodni na komórki ludzkie in vitro (zwiększenie przeżywalności, zwiększenie proliferacji) przy jednoczesnym braku genotoksyczności.
5. Ekstrakt z błony owodniowej wykazuje właściwości gojenia z jednoczesną gwarancją bezpieczeństwa.