W latach 2018-2020 Spółka Multi Knife realizowała projekt badawczy pt. „Opracowanie prototypu zestawu diagnostycznego do wykrywania boreliozy z płynu stawowego”.
Najważniejszym rezultatem, który badacze planowali osiągnąć w wyniku realizacji projektu było stworzenie prototypu zestawu umożliwiającego wykrycie w sposób bezsporny i bezpośredni materiału genetycznego potwierdzającego zakażenie stawu krętkiem Borrelia.
Program badawczy został podzielony na część badań biologicznych oraz część badań inżynieryjnych i technicznych i objął 1000 osób badanych, zakażonych wcześniej boreliozą. Projekt zakładał powstanie zestawu diagnostycznego do wykrycia boreliozy stawowej później.
Przeprowadzone w ramach projektu prace miały pozwolić na rozwiązanie problemu diagnostycznego, jakim jest brak skutecznej metody wykrywania obecności i zakażenia boreliozą
W ramach realizowanego projektu, w jego wstępnym etapie wykonano ponad 500 pacjentom
z podejrzeniem zakażenia boreliozą badania typu Western Blot.
Charakterystyka wykonanych badań:
Jakościowe oznaczenie przeciwciał klasy IgM
Analizę jakościową in vitro ludzkich przeciwciał klasy IgM przeciwko antygenom Borrelia w surowicy pacjentów wykonano przy za pomocą testu typu line blot (Anty-Borrelia EUROLINE-RN-AT-avd (IgM), nr kat. DN 2131-3201-2 M, EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy) przy użyciu aparatu EUROBlotMaster (EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy). Krew od pacjentów pobrano do probówek z aktywatorem krzepnięcia (BD Vacutainer CAT Plus Blod Collection Tubes, nr kat. 367896, Becton Dickinson, East Rutherford, NJ, USA), następnie odwirowano, a uzyskana surowicę przekazano do analizy. Wszystkie analizy wykonywano zgodnie z instrukcją producenta. Ocenę wyników przeprowadzano za pomocą programu EuroLineScan (EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy).
Jakościowe oznaczenie przeciwciał klasy IgG
Analizę jakościową in vitro ludzkich przeciwciał klasy IgG przeciwko antygenom Borrelia w surowicy pacjentów wykonano przy za pomocą testu typu line blot (Anty-Borrelia EUROLINE-RN-AT (IgG), nr kat. DN 2131-3201 G, EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy) przy użyciu aparatu EUROBlotMaster (EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy). Krew od pacjentów pobrano do probówek z aktywatorem krzepnięcia (BD Vacutainer CAT Plus Blod Collection Tubes, nr kat. 367896, Becton Dickinson, East Rutherford, NJ, USA), następnie odwirowano, a uzyskana surowicę przekazano do analizy. Wszystkie analizy wykonywano zgodnie z instrukcją producenta. Ocenę wyników przeprowadzano za pomocą programu EuroLineScan (EUROIMMUN, Lubeka, Niemcy).
Na podstawie wyników tych badań oraz na bazie specjalistycznych konsultacji z lekarzem, potwierdzonej boreliozy i informacji od pacjenta o dokuczającym bólu stawów, wyselekcjonowano grupę 200 osób z podejrzeniem boreliozy stawowej, która wzięła udział w dalszych badaniach: RT-PCR. Grupę 200 osób z podejrzeniem boreliozy stawowej zespół badawczy podzielił na 4 grupy po 50 osób. Pacjenci zostali poddani prowokacji różnymi substancjami w celu uzyskania informacji, która substancja najlepiej uwalnia płyn stawowy z maziówki.
Analiza PCR płynu stawowego na obecność DNA Borrelia
Płyn stawowy ze stawu kolanowego wyselekcjonowanych pacjentów pobrano do sterylnych falkonów na Oddziale Urazowo-Ortopedycznym Szpitala Kieleckiego. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu kolumienkowego GeneProof PathogenFree DNA Isolation PCR Kit (nr kat. IDNA050, GeneProof a.s., Brno, Republika Czeska) zgodnie z instrukcją producenta. Następnie wyizolowany materiał poddano analizie real-time PCR przy użyciu zestawu GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (nr kat. BB/ISEX/100, GeneProof a.s., Brno, Republika Czeska). Przy czym kontrola wewnętrzna była dodawana na etapie izolacji w stosunku 1 : 10 (kontrola : próbka badana), w celu jednoczesnej kontroli jakości izolacji oraz potencjalnej inhibicji reakcji PCR. Mieszaninę reakcyjną przygotowano i amplifikację prowadzono zgodnie z instrukcją producenta zestawu na aparacie LightCycler® 96 Instrument (Roche Applied Science, Penzberg, Germany).
Badanie RT-PCR wykonano u 200 chorych. Jednakże nie osiągnięto ani jednego pozytywnego wyniku badania – w żadnej z próbek pobranego od pacjentów materiału nie znajdowało się DNA krętka Borreli.
Osiągnięte wyniki serologiczne pozwalałyby twierdzić, że dokładne badanie genetyczne wykaże obecność krętków Borreli w stawie. Jednakże badanie genetyczne nie potwierdziło takiej tezy. Należy zatem przeprowadzić dyskusję błędu, dlaczego tak szeroki materiał badawczy nie pozwolił na uzyskanie nawet jednego wyniku pozytywnego w badaniu genetycznym.
Nasuwają się nam dwie możliwe wersje przyczyn zaistniałego stanu rzeczy:
Wersja nr 1
Borelioza stawowa późna nie istnieje. Wynik badania RT PCR pokazuje, że nie można łączyć objawów bólowych stawów, szczególnie kolana, z zakażeniem wcześniejszym boreliozą. Mogą być to bóle związane z innymi chorobami wymienionymi w wywiadzie (chorobą zwyrodnieniową, łuszczycowym zapaleniem stawów, reumatoidalnym zapaleniem stawów, dną moczanową).
Wersja nr 2
Ból stawów w przebiegu późnym od boreliozy pierwotnej może mieć charakter neuropatyczny. Ból może być związany z dysfunkcją nerwów unerwiających torebki stawowe. Za taką tezą przemawia fakt, że krętki Borreli są znane z produkcji bardzo silnej neurotoksyny, uszkadzając zarówno ośrodkowy jak i obwodowy układ nerwowy.
Z uwagi na nieosiągnięcie założonego, prognozowanego celu – nieosiągnięcie pozytywnych wyników badania genetycznego z płynu stawowego, odstąpiono od dalszych badań chorych.
Uzyskane wyniki stoją w sprzeczności z wynikami zawartymi w publikacjach indeksowanych dostępnych w światowych bazach danych. Jednakże publikacje wcześniejsze nie rozdzielały boreliozy na późną i wczesną. Wydaje się rzeczą racjonalną, że uzyskane dodatnie wyniki badań genetycznych dotyczyły wczesnego okresu rozwoju choroby, gdzie występuje duża ekspresja genów boreliozy
w płynach ustrojowych, zaś w boreliozie późnej ekspresja ta nie występuje i zaburza wynik diagnostyczny.
W załączeniu przedkładamy wyniki badań trojga przykładowych pacjentów: Pani Teresy, Pani Zofii
i Pana Bogdana. Ci pacjenci ponad wszelką wątpliwość byli IgG pozytywni, mieli również dodatnie bądź graniczne wyniki IgM, natomiast po wykonaniu u nich analizy PCR płynu stawowego na obecność DNA krętka Borreli, okazało się, że jest on negatywny (jak wcześniej wspomniano, wszystkich 200 przebadanych pacjentów miało negatywne wyniki PCR).
Opis załączonych wyników:
- Wyniki analiz WesternBlot – 6 plików (troje pacjentów, dla każdego 1 wynik IgG i 1 wynik IgM), pliki opisane imieniem pacjenta oraz rodzajem badanych przeciwciał (IgM lub IgG)
- Wyniki analizy PCR – 3 pliki pdf. przygotowywane przez laboratorium, na potrzeby wydania wyników pacjentom – wszystkie negatywne. Pliki opisane imieniem pacjenta, z dopiskiem “PCR”
- Pliki excel ze szczegółowymi danymi z analizy PCR. Odpowiednia próbka znajduje się
w zaznaczonym wierszu i oznaczona jest imieniem pacjenta. - Pliki .png – zdjęcia krzywych amplifikacji produktów PCR. Pliki te są nazwane imieniem pacjenta.
Krzywa “leżąca płasko”/równolegle w stosunku do osi x, zielona, ciągła – kanał FAM – brak DNA bakterii – wynik ujemny u wszystkich pacjentów.
Krzywa wzrastająca od około 32 cyklu, zielona, przerywana – kanał HEX – produkt amplifikacji kontroli wewnętrznej (standardu DNA) – amplifikacja we wszystkich próbkach, czyli wszystkie próbki przygotowane prawidłowo do analizy.
Krzywa równoległa do osi x, niebieska, przerywana – tzw. threshold, dotyczy ustawień aparatu – nie dotycz wyników.
Dr n. med. Arkadiusz Granek
